腦脊液細胞學的診斷方法及要點
-文章轉載：華山腦脊液檢驗之窗 原創： 王迪
國內腦脊液細胞學檢查目前存在的主要問題有：1.部分臨床醫生對腦脊液細胞學檢查的重要性認識不足，2.缺乏標準制片流程（由于腦脊液細胞數較低，普通制片流程往往檢出率很低，標準制片流程對提高檢出率至關重要），3.從事細胞學檢查的有經驗的檢驗或病理醫師嚴重不足。然而以下情況還是有必要進行腦脊液細胞學檢查：1）腦脊液細胞計數增多；2）CT陰性的疑似蛛網膜下腔出血；3）排查腫瘤性腦膜炎；4）MRI提示腦膜強化。腦脊液細胞形態學檢查作為快速、有效及低成本的方法，已經成為我院的特色檢查項目，是神經系統疾病的篩查與診斷工具。在這里，我們提供了一份從腦脊液樣本處理到CSF細胞計數和細胞學分類、細胞學診斷的實踐總結給廣大同仁參考交流。為了解腦脊液檢查現狀，文末我們還提供了一份腦脊液檢查現狀的小調查，懇請各位同仁撥冗填寫，并歡迎多提寶貴建議！
概述
腦脊液（CerebroSpinal Fluid, CSF）細胞學，是神經病學家的最重要工具之一，包含總體細胞計數和細胞學分類，為中樞神經系統及其涵蓋的一系列病理狀況提供重要的第一手信息。CSF樣本需要立即處理，盡可能在收集后1小時內處理。離心制片后，我們實驗室通常采用瑞氏染色進行形態學檢查。對于細胞背景提示有感染存在時，我們會加做抗酸染色、革蘭染色等，并尋找相關病原體。發現異形細胞時，我們常通過免疫細胞化學染色來進一步確定并鑒定腫瘤細胞。在正常CSF細胞以T淋巴細胞為主，少量單核巨噬細胞，偶見B淋巴細胞。細胞數明顯增加，鏡下以中性粒細胞為主時多見于細菌性腦膜炎，需進一步尋找胞內細菌證據。以淋巴細胞和單核細胞為主的細胞背景多見于病毒感染和慢性炎癥。以混雜細胞反應為背景時，可發生于結核性腦膜炎。吞噬紅細胞或含血紅蛋白降解產物片段的巨噬細胞（后者稱為含鐵血黃素細胞），均提示陳舊性的蛛網膜下腔出血。鏡下發現異型細胞懷疑腫瘤時，需結合臨床及免疫細胞化學染色綜合判斷。
處理時間
由于腦脊液樣本在體外2小時后細胞快速裂解。與腦脊液生化分析不同，CSF細胞學和細胞計數檢查需要立即處理新鮮液體，最好在腰椎穿刺后1小時內。按照我們實驗室的經驗，腦脊液采集后在4攝氏度下保存條件下存放4小時，細胞形態基本可保持完整。
外觀檢查
新鮮CSF的肉眼檢查可提供重要的第一手信息，應作為CSF檢驗報告的一部分。正常腦脊液清澈無色。如果白細胞計數高于1,000/μL，腦脊液顏色可呈現混濁和不透明。化膿性炎癥通常呈現出濃稠和黃色至綠色。明顯呈現的紅色提示腦脊液樣本可能發生了血液污染。連續數管的樣本收集，可以幫助區分腰穿刺術本身相關的創傷性血液污染或真正的蛛網膜下腔出血：如果連續的CSF樣本逐漸變清提示可能是進針時傷及血管所致，而持續性變色則表明真正的蛛網膜下腔出血。黃變癥（Xanthochromia）即黃色變色，在離心后持續存在，它是由膽紅素水平升高引起的。值得注意的是，創傷性血液污染可導致CSF細胞計數增加，CSF混入外周血時，CSF細胞學可出現明顯的偏差。我們曾遇到過腰椎穿刺被骨髓細胞污染的腦脊液標本。因此腦脊液細胞學標本最好是穿刺后的第二管沒有血液混入的樣本。
細胞計數
使用牛鮑氏（Neubauer）計數板進行細胞計數。正常細胞計數范圍為白細胞每微升0至4個（mm^3）。高于5/μL 的細胞計數被稱為白細胞異常升高或細胞增多癥。未成熟的血腦屏障細胞滲透性較高，在足月新生兒腦脊液中常見細胞數高達10/ μL。在早產兒中水平甚至可以達到30 / μL。然而，在產后第六周，細胞計數逐漸下降并且任何持續升高的細胞計數被認為病理性升高。按升高的程度可分為輕度（5-50/ μL），中度（50-150 / μL）或嚴重（150-3,000 / μL）。下表總結了典型的細胞計數及其相關的病理表現。
細胞計數通常在細菌性腦膜炎中升高最明顯，在慢性或病毒感染中則呈中度升高。值得注意的是，我們發現約1/3腫瘤細胞腦脊液播散的患者，其細胞計數并不明顯升高，因此無論細胞計數如何，都應盡量進行CSF細胞學檢查。另外肉眼可見的血液污染不可避免導致CSF白細胞計數增加，鏡下以中性粒細胞為主的表現。在此情況下，為了估計真實的CSF細胞計數，每1,000-1,500個紅細胞中減去一個白細胞。腦室引流的腦脊液細胞計數通常與腰穿的結果無明顯差異。在實踐中，我們通過牛鮑氏計數板計數細胞數量的同時，會對濕片中的有核細胞大小進行初步評估，對于疑似有異常細胞時，我們會加制多張細胞片，以備進行免疫組化染色。
離心方法和常規染色
對于細胞學診斷醫師而言，優質的細胞學制片效果至關重要。在Sayk（1954年）和Watson（1966年）等相繼發明了＂玻片細胞沉淀法”和＂細胞玻片離心沉淀法”后，能收集到的腦脊液細胞達90%以上，該方法才有了飛速的發展，成為了一門新型學科——腦脊液細胞學。我國的腦脊液細胞學研究開始于20世紀60年代，侯熙德教授和粟秀初教授先后建立了腦脊液細胞學檢查室，并研制成功了自然沉淀器和微型腦脊液細胞玻片離心沉淀儀。1986年孔繁元教授引進玻片離心沉淀儀并國產化，后第四軍醫大學西京醫院又對原沉淀儀進行了改進，新一代細胞涂片離心沉淀儀已經問世并投入使用，細胞回收率和完整率分別達80.5% 和99.9%。我們在此基礎上改進的腦脊液細胞收集器，進一步提升了腦脊液細胞的收集效率和細胞形態的完整性。
取部分CSF并以600-700rpm離心，專用的吸水紙可吸去液體成分，而細胞則沉淀在顯微鏡載玻片上。常規的染色方案有：
麥-格倫沃爾德-姬姆薩（May-Grunwald-Giemsa，MGG）
MGG是評估細胞學特征的標準染色。它由伊紅、亞甲藍、甲醇和吉姆薩染料組成，細胞核通常比呈現紅色、藍色或紫色的細胞質更暗。類似地，瑞氏（Wright)染色，主要染料也是伊紅和亞甲藍，該染色常用于血涂片和骨髓細胞學血檢查。另外與MGG相比，瑞氏染色的時間較短，但染色效果稍差一些。
革蘭氏染色（Gram）
革蘭氏染色可以更好地區分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。前者呈現藍色至紫色，后者呈現紅色。與其他染色相比，通常使用油鏡在未覆蓋的載玻片上，并在高放大倍數（400*，1000*）下檢查。需要注意的是，革蘭氏染色的敏感性低于CSF微生物培養。
抗酸染色（Ziehl-Neelsen）
抗酸染色適用于疑似結核性腦膜炎的情況。它將分枝桿菌呈現為明亮的紅色絲狀結構，而在MGG或革蘭氏染色下顯示效果不佳。
其他染色
其他染色包括：1）印度墨汁染色，用于鑒定隱球菌（特征為周圍膠囊狀的小圓形、致密結構）。2）普魯士藍染色，用于鑒定血紅蛋白降解后在巨噬細胞中沉積的含鐵血黃素。3）高碘酸 - 希夫（Periodic Acid–Schiff，PAS）染色，可有助于鑒定真菌。
免疫細胞化學標記
在疑似腫瘤性腦膜炎的情況下，免疫細胞化學可用于檢測和進一步表征腫瘤細胞。常用的抗體包括抗細胞角蛋白（anticytokeratin，CK）或上皮細胞膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA），兩者均可證實上皮源性腫瘤細胞。同樣，淋巴細胞標志物，CD3+(T淋巴細胞)、CD20+(B淋巴細胞)、MUM1、PAX5可作為B細胞腫瘤的鑒別抗體。我們在選擇免疫組化抗體時需根據瑞氏下的細胞形態對疾病進行初步判斷，并結合患者的綜合情況來選擇。腦脊液細胞免疫組化與病理科的組織免疫組化最大的不同是，病理組織可以切無限多的切片，而腦脊液的細胞片顯得更加的珍貴，每一個抗體的選擇都是基于對疾病的鑒別診斷。
腦脊液細胞學
以下章節將詳細敘述各種CSF細胞計數升高的不同情況下，細胞學的詳細形態學表現。CSF細胞學檢查最好在專們的實驗室進行，其中要有經驗豐富的、熟悉細胞學特征的檢驗醫師。
圖1 粒細胞的表現特征：（A）正常腦脊液：可見淋巴細胞和單核細胞。（B）細菌性腦膜炎，中性粒細胞為主，可見大量細胞內和細胞外細菌。（C）嗜酸性腦膜炎，具有特征性的雙核型嗜酸性粒細胞。（D）混合粒細胞、淋巴細胞、單核細胞表現。注意單個活化的淋巴細胞，擴大的細胞質、典型的核周間隙。
1.正常腦脊液：存在淋巴細胞和單核細胞（圖1A）。淋巴細胞通常呈圓形大小均一，細胞核染色質密集，細胞質狹窄、呈嗜堿性單核細胞比淋巴細胞更大，細胞核橢圓形、腎形，細胞質呈更寬的灰色。偶可見中性粒細胞以及軟骨細胞這些軟骨細胞呈現豐富的嗜酸性細胞質，較小的、染色質密集的細胞核。
2.細菌性腦膜炎：沒有明顯血液污染的情況下，由中性粒細胞為主的細胞形態表現，細胞內可找到細菌。細菌通常可變形、形狀不同且均一的結構——球菌或桿菌，有時周圍可見暈環，細胞內和細胞外均可見。值得注意的是，偶可見在單純二次污染的腦脊液樣本中，細胞外細菌的大量過度生長。革蘭氏染色可進一步區分革蘭氏陽性和陰性細菌。例如，呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌提示肺炎鏈球菌，而革蘭氏陰性球菌提示腦膜炎奈瑟球菌。然而，革蘭氏染色經常產生兩性染色結果，可能得到模棱兩可的解釋而降低了敏感性。因此微生物培養被認為才是細菌檢查的金標準。而且CSF培養可同時進行抗菌藥物測試，尤其有利于指導難治性腦膜炎的治療。對于免疫抑制患者，需要警惕去細胞細菌性腦膜炎（acellular bacterial meningitis），表現為大量的細菌、缺失的粒細胞正常反應、正常的細胞計數。
3.中性粒細胞比例升高的其他疾病：不管細胞計數絕對數是否升高，中性粒細胞比例升高的情況，包括病毒感染的早期階段，對中風、出血、癲癇發作或神經外科手術的非特異性反應。
4.嗜酸性粒細胞為特征的疾病：嗜酸性粒細胞具有典型的特征性雙核型，細胞質內密集的、豐富的嗜酸性顆粒（圖1 C）。它們不存在于正常腦脊液中。嗜酸性粒細胞為主的特征表現，臨床診斷指向寄生蟲感染或異物反應，例如永久性腦室引流。結核性或肉芽腫性腦膜炎以及霍奇金淋巴瘤，偶爾會出現嗜酸性粒細胞。
5.混合細胞為特征：同時由粒細胞、淋巴細胞、單核細胞組成，盡管比例是可變的。它被認為是非特異性的、在許多臨床條件下可見，包括炎性、反應性條件（圖1D）。特殊染色如抗酸染色或PAS染色分別有助于鑒別結核性或真菌性藥物，盡管陰性結果不能排除這些疾病。微生物培養可增加診斷準確性，而聚合酶鏈反應（PCR）的分析越來越多地用于臨床，因為它們介于耗時且昂貴的微生物培養和廉價但不準確的革蘭氏染色之間。
6.淋巴細胞活化為特征：淋巴細胞活化導致顯著的細胞增大、具有灰暗的嗜堿性細胞質和特征性核周間隙（圖2A）。活化淋巴細胞可分化為成熟的漿細胞，后者呈現偏位的細胞核，及其獨特的粗染色質結構（圖2B）。偶爾可見雙核型（圖2C）。激活的淋巴細胞和成熟漿細胞之間的區別有時較困難，因為分化的中間形式較常見并且反映了持續的細胞分化狀態。這兩種細胞類型可見于病毒或自身免疫相關的疾病，以及對非特異性腦膜刺激的反應，包括化學或機械性傷害性刺激。在神經疏松癥或皰疹病毒感染中，過度活化淋巴細胞可能會與惡性淋巴瘤細胞較難鑒別（圖2D）。惡性淋巴組織增生性疾病的特征是均一的單克隆細胞群，但更廣泛的、大小可變的淋巴細胞以 及成熟的漿細胞則支持炎癥感染診斷。另外髓內多克隆免疫球蛋白的檢測可用于惡性腫瘤的進一步鑒別診斷。免疫細胞化學和/或熒光激活細胞分類、細胞群的詳細免疫表型分析是評估細胞單克隆性的進一步有用工具。
圖2 淋巴細胞的各種表現特征：（A）從小到大的各異淋巴細胞表現。（B）具有特征性粗染色質結構和細胞質偏位的漿細胞。（C）偶見雙核的漿細胞（箭頭所示）。（D）顯著活化，包括類淋巴瘤細胞的大淋巴細胞以及有絲分裂像的淋巴細胞（箭頭）。
7.蛛網膜下腔出血與新鮮血液污染的鑒別診斷：不同于新鮮血液污染（圖3 A），噬紅細胞、噬鐵細胞的存在，傾向于先前的蛛網膜下腔出血診斷（圖3 B和C）。兩種細胞類型均為巨噬細胞，即由空泡化的活化單核細胞來源，吞噬了紅細胞、血紅蛋白降解后產生的藍色、含鐵血血黃素。值得注意的是，反復腰椎穿刺時可能也會遇到孤立的噬鐵細胞，是由腰穿穿刺產生的。膽紅素結晶是由膽紅素累積引起的，小的、黃色至橙色晶體，見于細胞外或噬鐵細胞內（圖3D）。
圖3 出血性疾病特征：（A）新鮮血液污染，密集的紅細胞、偶見中性粒細胞。（B）噬紅細胞，成蔟的，大量空泡化的細胞質中，可見吞噬的紅細胞殘片。（C）噬鐵細胞，藍色、含鐵血紅素顆粒的、泡沫狀細胞質。（D）膽紅素結晶，紅細胞包繞、黃色、膽紅素結晶（箭頭所示）。
8.腫瘤性腦膜炎的表現：腫瘤細胞通常表現為大細胞的，不規則形狀的、染色質豐富的細胞核，可見明顯核仁，和暗色的嗜堿性細胞質（圖4 A）。核質比通常較高。腺癌細胞通常細胞質可見較大的空泡，為存儲粘蛋白的囊泡。有時因囊泡較大使得細胞核偏位（稱印戒細胞）。有些癌細胞呈現不規則的細胞質突起和偽足（圖4 C）。同樣，多發性有絲分裂象也支持腫瘤源性細胞，而正常或炎性反應細胞中偶見單個有絲分裂（圖4 C）。密集的、相對單一形狀的細胞群提示淋巴瘤（圖4 D）。免疫細胞化學標記（如上皮來源的癌細胞的角蛋白標記、血液學標記等）可進一步精確的亞型分析（圖4 B，D和F）。
國內腦脊液細胞學檢查目前存在的主要問題有：1.部分臨床醫生對腦脊液細胞學檢查的重要性認識不足，2.缺乏標準制片流程（由于腦脊液細胞數較低，普通制片流程往往檢出率很低，標準制片流程對提高檢出率至關重要），3.從事細胞學檢查的有經驗的檢驗或病理醫師嚴重不足。然而以下情況還是有必要進行腦脊液細胞學檢查：1）腦脊液細胞計數增多；2）CT陰性的疑似蛛網膜下腔出血；3）排查腫瘤性腦膜炎；4）MRI提示腦膜強化。腦脊液細胞形態學檢查作為快速、有效及低成本的方法，已經成為我院的特色檢查項目，是神經系統疾病的篩查與診斷工具。在這里，我們提供了一份從腦脊液樣本處理到CSF細胞計數和細胞學分類、細胞學診斷的實踐總結給廣大同仁參考交流。為了解腦脊液檢查現狀，文末我們還提供了一份腦脊液檢查現狀的小調查，懇請各位同仁撥冗填寫，并歡迎多提寶貴建議！
概述
腦脊液（CerebroSpinal Fluid, CSF）細胞學，是神經病學家的最重要工具之一，包含總體細胞計數和細胞學分類，為中樞神經系統及其涵蓋的一系列病理狀況提供重要的第一手信息。CSF樣本需要立即處理，盡可能在收集后1小時內處理。離心制片后，我們實驗室通常采用瑞氏染色進行形態學檢查。對于細胞背景提示有感染存在時，我們會加做抗酸染色、革蘭染色等，并尋找相關病原體。發現異形細胞時，我們常通過免疫細胞化學染色來進一步確定并鑒定腫瘤細胞。在正常CSF細胞以T淋巴細胞為主，少量單核巨噬細胞，偶見B淋巴細胞。細胞數明顯增加，鏡下以中性粒細胞為主時多見于細菌性腦膜炎，需進一步尋找胞內細菌證據。以淋巴細胞和單核細胞為主的細胞背景多見于病毒感染和慢性炎癥。以混雜細胞反應為背景時，可發生于結核性腦膜炎。吞噬紅細胞或含血紅蛋白降解產物片段的巨噬細胞（后者稱為含鐵血黃素細胞），均提示陳舊性的蛛網膜下腔出血。鏡下發現異型細胞懷疑腫瘤時，需結合臨床及免疫細胞化學染色綜合判斷。
處理時間
由于腦脊液樣本在體外2小時后細胞快速裂解。與腦脊液生化分析不同，CSF細胞學和細胞計數檢查需要立即處理新鮮液體，最好在腰椎穿刺后1小時內。按照我們實驗室的經驗，腦脊液采集后在4攝氏度下保存條件下存放4小時，細胞形態基本可保持完整。
外觀檢查
新鮮CSF的肉眼檢查可提供重要的第一手信息，應作為CSF檢驗報告的一部分。正常腦脊液清澈無色。如果白細胞計數高于1,000/μL，腦脊液顏色可呈現混濁和不透明。化膿性炎癥通常呈現出濃稠和黃色至綠色。明顯呈現的紅色提示腦脊液樣本可能發生了血液污染。連續數管的樣本收集，可以幫助區分腰穿刺術本身相關的創傷性血液污染或真正的蛛網膜下腔出血：如果連續的CSF樣本逐漸變清提示可能是進針時傷及血管所致，而持續性變色則表明真正的蛛網膜下腔出血。黃變癥（Xanthochromia）即黃色變色，在離心后持續存在，它是由膽紅素水平升高引起的。值得注意的是，創傷性血液污染可導致CSF細胞計數增加，CSF混入外周血時，CSF細胞學可出現明顯的偏差。我們曾遇到過腰椎穿刺被骨髓細胞污染的腦脊液標本。因此腦脊液細胞學標本最好是穿刺后的第二管沒有血液混入的樣本。
細胞計數
使用牛鮑氏（Neubauer）計數板進行細胞計數。正常細胞計數范圍為白細胞每微升0至4個（mm^3）。高于5/μL 的細胞計數被稱為白細胞異常升高或細胞增多癥。未成熟的血腦屏障細胞滲透性較高，在足月新生兒腦脊液中常見細胞數高達10/ μL。在早產兒中水平甚至可以達到30 / μL。然而，在產后第六周，細胞計數逐漸下降并且任何持續升高的細胞計數被認為病理性升高。按升高的程度可分為輕度（5-50/ μL），中度（50-150 / μL）或嚴重（150-3,000 / μL）。下表總結了典型的細胞計數及其相關的病理表現。
細胞計數通常在細菌性腦膜炎中升高最明顯，在慢性或病毒感染中則呈中度升高。值得注意的是，我們發現約1/3腫瘤細胞腦脊液播散的患者，其細胞計數并不明顯升高，因此無論細胞計數如何，都應盡量進行CSF細胞學檢查。另外肉眼可見的血液污染不可避免導致CSF白細胞計數增加，鏡下以中性粒細胞為主的表現。在此情況下，為了估計真實的CSF細胞計數，每1,000-1,500個紅細胞中減去一個白細胞。腦室引流的腦脊液細胞計數通常與腰穿的結果無明顯差異。在實踐中，我們通過牛鮑氏計數板計數細胞數量的同時，會對濕片中的有核細胞大小進行初步評估，對于疑似有異常細胞時，我們會加制多張細胞片，以備進行免疫組化染色。
離心方法和常規染色
對于細胞學診斷醫師而言，優質的細胞學制片效果至關重要。在Sayk（1954年）和Watson（1966年）等相繼發明了＂玻片細胞沉淀法”和＂細胞玻片離心沉淀法”后，能收集到的腦脊液細胞達90%以上，該方法才有了飛速的發展，成為了一門新型學科——腦脊液細胞學。我國的腦脊液細胞學研究開始于20世紀60年代，侯熙德教授和粟秀初教授先后建立了腦脊液細胞學檢查室，并研制成功了侯氏自然沉淀器和粟氏FMU-5微型腦脊液細胞玻片離心沉淀儀。1986年孔繁元教授引進Cytospin-2 玻片離心沉淀儀并國產化，后第四軍醫大學西京醫院又對原粟氏沉淀儀進行了改進，新一代FMU-6細胞涂片離心沉淀儀已經問世并投入使用，細胞回收率和完整率分別達80.5% 和99.9%。我們在此基礎上改進的腦脊液細胞收集器，進一步提升了腦脊液細胞的收集效率和細胞形態的完整性。
取部分CSF并以600-700rpm離心，專用的吸水紙可吸去液體成分，而細胞則沉淀在顯微鏡載玻片上。常規的染色方案有：
麥-格倫沃爾德-姬姆薩（May-Grunwald-Giemsa，MGG）
MGG是評估細胞學特征的標準染色。它由伊紅、亞甲藍、甲醇和吉姆薩染料組成，細胞核通常比呈現紅色、藍色或紫色的細胞質更暗。類似地，瑞氏（Wright)染色，主要染料也是伊紅和亞甲藍，該染色常用于血涂片和骨髓細胞學血檢查。另外與MGG相比，瑞氏染色的時間較短，但染色效果稍差一些。
革蘭氏染色（Gram）
革蘭氏染色可以更好地區分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。前者呈現藍色至紫色，后者呈現紅色。與其他染色相比，通常使用油鏡在未覆蓋的載玻片上，并在高放大倍數（400*，1000*）下檢查。需要注意的是，革蘭氏染色的敏感性低于CSF微生物培養。
抗酸染色（Ziehl-Neelsen）
抗酸染色適用于疑似結核性腦膜炎的情況。它將分枝桿菌呈現為明亮的紅色絲狀結構，而在MGG或革蘭氏染色下顯示效果不佳。
其他染色
其他染色包括：1）印度墨汁染色，用于鑒定隱球菌（特征為周圍膠囊狀的小圓形、致密結構）。2）普魯士藍染色，用于鑒定血紅蛋白降解后在巨噬細胞中沉積的含鐵血黃素。3）高碘酸 - 希夫（Periodic Acid–Schiff，PAS）染色，可有助于鑒定真菌。
免疫細胞化學標記
在疑似腫瘤性腦膜炎的情況下，免疫細胞化學可用于檢測和進一步表征腫瘤細胞。常用的抗體包括抗細胞角蛋白（anticytokeratin，CK）或上皮細胞膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA），兩者均可證實上皮源性腫瘤細胞。同樣，淋巴細胞標志物，CD3+(T淋巴細胞)、CD20+(B淋巴細胞)、MUM1、PAX5可作為B細胞腫瘤的鑒別抗體。我們在選擇免疫組化抗體時需根據瑞氏下的細胞形態對疾病進行初步判斷，并結合患者的綜合情況來選擇。腦脊液細胞免疫組化與病理科的組織免疫組化最大的不同是，病理組織可以切無限多的切片，而腦脊液的細胞片顯得更加的珍貴，每一個抗體的選擇都是基于對疾病的鑒別診斷。
腦脊液細胞學
以下章節將詳細敘述各種CSF細胞計數升高的不同情況下，細胞學的詳細形態學表現。CSF細胞學檢查最好在專們的實驗室進行，其中要有經驗豐富的、熟悉細胞學特征的檢驗醫師。
圖1 粒細胞的表現特征：（A）正常腦脊液：可見淋巴細胞和單核細胞。（B）細菌性腦膜炎，中性粒細胞為主，可見大量細胞內和細胞外細菌。（C）嗜酸性腦膜炎，具有特征性的雙核型嗜酸性粒細胞。（D）混合粒細胞、淋巴細胞、單核細胞表現。注意單個活化的淋巴細胞，擴大的細胞質、典型的核周間隙。
1.正常腦脊液：存在淋巴細胞和單核細胞（圖1A）。淋巴細胞通常呈圓形大小均一，細胞核染色質密集，細胞質狹窄、呈嗜堿性單核細胞比淋巴細胞更大，細胞核橢圓形、腎形，細胞質呈更寬的灰色。偶可見中性粒細胞以及軟骨細胞這些軟骨細胞呈現豐富的嗜酸性細胞質，較小的、染色質密集的細胞核。
2.細菌性腦膜炎：沒有明顯血液污染的情況下，由中性粒細胞為主的細胞形態表現，細胞內可找到細菌。細菌通常可變形、形狀不同且均一的結構——球菌或桿菌，有時周圍可見暈環，細胞內和細胞外均可見。值得注意的是，偶可見在單純二次污染的腦脊液樣本中，細胞外細菌的大量過度生長。革蘭氏染色可進一步區分革蘭氏陽性和陰性細菌。例如，呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌提示肺炎鏈球菌，而革蘭氏陰性球菌提示腦膜炎奈瑟球菌。然而，革蘭氏染色經常產生兩性染色結果，可能得到模棱兩可的解釋而降低了敏感性。因此微生物培養被認為才是細菌檢查的金標準。而且CSF培養可同時進行抗菌藥物測試，尤其有利于指導難治性腦膜炎的治療。對于免疫抑制患者，需要警惕去細胞細菌性腦膜炎（acellular bacterial meningitis），表現為大量的細菌、缺失的粒細胞正常反應、正常的細胞計數。
3.中性粒細胞比例升高的其他疾病：不管細胞計數絕對數是否升高，中性粒細胞比例升高的情況，包括病毒感染的早期階段，對中風、出血、癲癇發作或神經外科手術的非特異性反應。
4.嗜酸性粒細胞為特征的疾病：嗜酸性粒細胞具有典型的特征性雙核型，細胞質內密集的、豐富的嗜酸性顆粒（圖1 C）。它們不存在于正常腦脊液中。嗜酸性粒細胞為主的特征表現，臨床診斷指向寄生蟲感染或異物反應，例如永久性腦室引流。結核性或肉芽腫性腦膜炎以及霍奇金淋巴瘤，偶爾會出現嗜酸性粒細胞。
5.混合細胞為特征：同時由粒細胞、淋巴細胞、單核細胞組成，盡管比例是可變的。它被認為是非特異性的、在許多臨床條件下可見，包括炎性、反應性條件（圖1D）。特殊染色如抗酸染色或PAS染色分別有助于鑒別結核性或真菌性藥物，盡管陰性結果不能排除這些疾病。微生物培養可增加診斷準確性，而聚合酶鏈反應（PCR）的分析越來越多地用于臨床，因為它們介于耗時且昂貴的微生物培養和廉價但不準確的革蘭氏染色之間。
6.淋巴細胞活化為特征：淋巴細胞活化導致顯著的細胞增大、具有灰暗的嗜堿性細胞質和特征性核周間隙（圖2A）。活化淋巴細胞可分化為成熟的漿細胞，后者呈現偏位的細胞核，及其獨特的粗染色質結構（圖2B）。偶爾可見雙核型（圖2C）。激活的淋巴細胞和成熟漿細胞之間的區別有時較困難，因為分化的中間形式較常見并且反映了持續的細胞分化狀態。這兩種細胞類型可見于病毒或自身免疫相關的疾病，以及對非特異性腦膜刺激的反應，包括化學或機械性傷害性刺激。在神經疏松癥或皰疹病毒感染中，過度活化淋巴細胞可能會與惡性淋巴瘤細胞較難鑒別（圖2D）。惡性淋巴組織增生性疾病的特征是均一的單克隆細胞群，但更廣泛的、大小可變的淋巴細胞以 及成熟的漿細胞則支持炎癥感染診斷。另外髓內多克隆免疫球蛋白的檢測可用于惡性腫瘤的進一步鑒別診斷。免疫細胞化學和/或熒光激活細胞分類、細胞群的詳細免疫表型分析是評估細胞單克隆性的進一步有用工具。
圖2 淋巴細胞的各種表現特征：（A）從小到大的各異淋巴細胞表現。（B）具有特征性粗染色質結構和細胞質偏位的漿細胞。（C）偶見雙核的漿細胞（箭頭所示）。（D）顯著活化，包括類淋巴瘤細胞的大淋巴細胞以及有絲分裂像的淋巴細胞（箭頭）。
7.蛛網膜下腔出血與新鮮血液污染的鑒別診斷：不同于新鮮血液污染（圖3 A），噬紅細胞、噬鐵細胞的存在，傾向于先前的蛛網膜下腔出血診斷（圖3 B和C）。兩種細胞類型均為巨噬細胞，即由空泡化的活化單核細胞來源，吞噬了紅細胞、血紅蛋白降解后產生的藍色、含鐵血血黃素。值得注意的是，反復腰椎穿刺時可能也會遇到孤立的噬鐵細胞，是由腰穿穿刺產生的。膽紅素結晶是由膽紅素累積引起的，小的、黃色至橙色晶體，見于細胞外或噬鐵細胞內（圖3D）。
圖3 出血性疾病特征：（A）新鮮血液污染，密集的紅細胞、偶見中性粒細胞。（B）噬紅細胞，成蔟的，大量空泡化的細胞質中，可見吞噬的紅細胞殘片。（C）噬鐵細胞，藍色、含鐵血紅素顆粒的、泡沫狀細胞質。（D）膽紅素結晶，紅細胞包繞、黃色、膽紅素結晶（箭頭所示）。
8.腫瘤性腦膜炎的表現：腫瘤細胞通常表現為大細胞的，不規則形狀的、染色質豐富的細胞核，可見明顯核仁，和暗色的嗜堿性細胞質（圖4 A）。核質比通常較高。腺癌細胞通常細胞質可見較大的空泡，為存儲粘蛋白的囊泡。有時因囊泡較大使得細胞核偏位（稱印戒細胞）。有些癌細胞呈現不規則的細胞質突起和偽足（圖4 C）。同樣，多發性有絲分裂象也支持腫瘤源性細胞，而正常或炎性反應細胞中偶見單個有絲分裂（圖4 C）。密集的、相對單一形狀的細胞群提示淋巴瘤（圖4 D）。免疫細胞化學標記（如上皮來源的癌細胞的角蛋白標記、血液學標記等）可進一步精確的亞型分析（圖4 B，D和F）。
圖4 腫瘤性腦膜炎的表現特征：（A）多形性腫瘤細胞簇，在乳腺癌患者中偶爾有粘液性細胞質囊泡。（B）細胞角蛋白的免疫細胞化學證實了上皮來源。（C）多個腫瘤細胞在患有肺癌的患者中顯示出不規則的細胞質突起。注意兩個有絲分裂的數字。（D）上皮細胞膜抗原的免疫細胞化學顯示出強烈的膜質和彌散性細胞質標記。（F）免疫化學證實抗-CD20陽性，（E）彌漫性大B細胞淋巴瘤中密集的單一形態細胞。
參考文獻
Rahimi, Jasmin, and Adelheid Woehrer. "Overview of cerebrospinal fluid cytology." Handbook of clinical neurology. Vol. 145. Elsevier, 2018. 563-571.
圖4 腫瘤性腦膜炎的表現特征：（A）多形性腫瘤細胞簇，在乳腺癌患者中偶爾有粘液性細胞質囊泡。（B）細胞角蛋白的免疫細胞化學證實了上皮來源。（C）多個腫瘤細胞在患有肺癌的患者中顯示出不規則的細胞質突起。注意兩個有絲分裂的數字。（D）上皮細胞膜抗原的免疫細胞化學顯示出強烈的膜質和彌散性細胞質標記。（F）免疫化學證實抗-CD20陽性，（E）彌漫性大B細胞淋巴瘤中密集的單一形態細胞。
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Rahimi, Jasmin, and Adelheid Woehrer. "Overview of cerebrospinal fluid cytology." Handbook of clinical neurology. Vol. 145. Elsevier, 2018. 563-571.
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